PCR (Polymerase Chain Reaction) ngày nay có thể được xem là một kỹ thuật cơ bản nhất mà mọi nhà nghiên cứu về sinh học phân tử cần phải tự trang bị cho mình. Trong đại đa số các quy trình như phát hiện gene mục tiêu, tạo dòng, giải trình tự, biểu hiện gene, v.v…, PCR ít nhiều cũng để lại dấu ấn của mình ở một mức độ nào đó.
Tuy nhiên, như mọi kỹ thuật khác, PCR cũng có những điểm mạnh và điểm yếu của mình. Nếu người sử dụng hiểu rõ và biết vận dụng linh hoạt thì tôi tin chắc PCR sẽ trở thành một vũ khí tuyệt vời để đưa anh ta đến những thắng lợi lẫy lừng.
Vậy thì hôm nay chúng ta thử tìm hiểu xem những ưu-nhược điểm của PCR là gì nhé. Tôi chỉ xin lưu ý nhỏ ở đây là, bài viết tập trung phân tích những nội dung liên quan đến cặp đôi “PCR” và “Điện di trên gel agarose” thôi nhé. Trong trường hợp bạn đọc muốn kết hợp PCR với một phương pháp phát hiện sản phẩm PCR khác thì … liên hệ trực tiếp với tôi để thảo luận nha.
Người ta nói “Tốt khoe, xấu che” nên dĩ nhiên chúng ta nên tìm hiểu những ưu điểm của PCR trước đã.
Thứ nhất, chi phí đầu tư nghiên cứu thấp hơn so với việc sử dụng Real-time PCR. Kỹ thuật PCR chỉ cần sử dụng các mồi ngăn ngắn, giá đầu tư rất rẻ, chỉ khoảng 12 USD/mồi. Trong khi đó, nếu sử dụng Real-time PCR kết hợp với các loại mẫu dò huỳnh quang thì không cần biết có nghiên cứu thành công hay không, bạn vẫn phải trả một chi phí ban đầu khá cao, tầm 200 USD/mẫu dò. Nếu bạn muốn làm multiplex, tức là phát hiện nhiều gene trong cùng 1 phản ứng, thì chi phí bỏ ra ban đầu cho Real-time PCR rất cao, hơn 1200 USD cho 4-plex hoặc 1500 USD cho 5-plex. Ngược lại, với PCR, 1 phản ứng 5-plex cùng lắm chỉ tốn 120 USD!
Thứ hai, chi phí đầu tư thiết bị cũng khá “mềm”. Để thực hiện phản ứng PCR, bạn chỉ cần đầu tư 1 máy PCR với tầm giá khoảng 3000-5000 USD/máy. Trong khi đó, con số này sẽ được nhân lên 10 lần nếu bạn muốn sử dụng Real-time PCR. So với những thiết bị chuyên dụng khác trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử thì máy PCR vẫn thuộc dạng dễ mua nhất!
Thứ ba, dễ dàng phân tích kết quả! Nếu các bạn từng tìm hiểu qua PCR-Điện di hoặc xem clip … thì hẳn các bạn sẽ đồng ý với tôi rằng việc phân tích kết quả điện di sản phẩm PCR là không quá phức tạp, hễ có băng đúng kích thước thì kết luận dương tính, không có băng thì kết luận âm tính. Với Real-time PCR thì ngược lại, người dùng luôn phải sử dụng các phần mềm đi kèm thiết bị để phân tích kết quả với nhiều thông số khác nhau. Những thông số này cần được hiểu rõ và điều chỉnh theo đúng nguyên tắc thì kết quả mới đáng tin cậy.
Vào đầu năm 2014, trong một chuyến đi công tác xuống chi cục Nuôi trồng thủy sản Bạc Liêu, tôi từng thắc mắc với anh trưởng phòng xét nghiệm PCR rằng tại sao các anh chị không sử dụng máy Real-time PCR mới mua mà vẫn dùng các máy PCR như từ trước đến nay. Anh trả lời: Việc phân tích kết quả trên máy Real-time PCR mang nặng cảm tính quá, muốn kết quả dương tính thì kéo đường ngưỡng xuống cho cắt với đồ thị, muốn âm tính thì kéo lên thật cao (?!). Làm PCR thì dễ hơn, băng xuất hiện hay không là kết luận được liền! Tôi ngậm ngùi gật gù theo anh, mặc dù trong lòng cũng muốn chia sẻ với anh giải pháp cho vấn đề này.
Thứ tư, khả năng multiplex mạnh mẽ hơn Real-time PCR. Trong nguyên tắc của quy trình PCR-Điện di, các sản phẩm nhân bản từ những gene khác nhau sẽ được phân biệt dựa trên kích thước tính bằng “cặp nucleotide” hay “base pair”. Thế nên, về lý thuyết, nếu chúng ta muốn phát hiện 10 gene trong cùng 1 phản ứng PCR thì chỉ cần tập trung thiết kế 10 cặp mồi (primer) khác nhau để tạo ra 10 sản phẩm PCR có kích thước khác nhau là xong.
Mặc dù tôi biết để tạo ra một phản ứng PCR “siêu nhân” như thế này là không dễ chút xíu nào, nhưng hoàn toàn khả thi nếu chúng ta kiên nhẫn và cẩn thận trong thiết kế. Thực tế thì vào năm 2013, tôi cùng một đồng nghiệp cũng đã phát triển thành công một phản ứng multiplex phát hiện cùng lúc 9 genotype “nguy cơ cao” của Human Papillomavirus (Hình 1).
Trong khi đó, do giới hạn về khả năng đọc huỳnh quang của thiết bị, khi bạn dùng Real-time PCR thì cao nhất bạn chỉ có thể phát hiện được 6 gene mục tiêu, với không ít khó khăn trong thiết kế mẫu dò cũng như chi phí đầu tư rất cao như đã đề cập ở trên!
Với những điều tôi vừa đề cập ở trên, chắc hẳn những bạn đang sử dụng PCR sẽ mừng thầm vì cho rằng mình đang sở hữu một vũ khí quá tuyệt vời. Đợi đã, hãy tiếp tục theo dõi phần chia sẻ về những nhược điểm của PCR bên dưới nữa nhé.
Thứ nhất, nguy cơ ngoại nhiễm rất cao! Khi thực hiện quy trình PCR-Điện di, bạn bắt buộc phải mở nắp phản ứng chứa sản phẩm PCR để tiến hành nạp vào gel điện di. Thao tác mở nắp này, cũng như các bước trộn sản phẩm PCR bằng micropipette sau đó chắc chắn sẽ làm phóng thích ít nhiều sản phẩm PCR vào không khí, đặc biệt khi hàm lượng mạch khuôn cho PCR ban đầu là cao (105 đến 108 copies/phản ứng). Lượng sản phẩm PCR này sẽ lơ lửng trong không khí suốt nhiều…năm liền và rơi vào những ống phản ứng PCR của những lần chạy kế tiếp, và tất nhiên sẽ gây ra hiện tượng dương tính giả.
Vào năm 2008-2009, công ty tôi làm lúc đó cũng bị “dính” thảm họa PCR này và phải tiêu tốn hàng trăm triệu đồng để khắc phục. Mãi đến năm 2013, trong một thử nghiệm tình cờ, chúng tôi vẫn gặp kết quả dương tính giả do những “người cũ” gây ra. 🙁
Vậy còn Real-time PCR thì sao? Câu trả lời là vẫn có nguy cơ bị ngoại nhiễm nhưng thấp hơn nhiều, vì ống chứa sản phẩm PCR luôn được đóng kín từ lúc bắt đầu cho đến khi kết thúc. Thảm họa sẽ xảy ra nếu bạn sử dụng những loại tube chứa phản ứng kém chất lượng, nắp dễ bị bật ra khi chỉ tác động nhẹ, hoặc do ai đó vô tình hay hữu ý mở nắp tube trong không gian làm việc.
Thứ hai, phản ứng PCR thường có độ nhạy thấp hơn Real-time PCR. Có vài yếu tố dẫn đến kết luận này như: sai số trong bước điện di sản phẩm PCR, chất lượng gel agarose không đồng đều, chất phát huỳnh quang trong gel có độ nhạy không cao, mắt người hoặc máy ảnh chụp hình gel agarose có độ tinh kém hơn nhiều lần so với đầu đọc huỳnh quang của máy Real-time PCR, v.v…
Thứ ba, độ đặc hiệu thấp hơn Real-time PCR. Điều này chỉ đúng khi bạn có sử dụng mẫu dò trong phản ứng Real-time PCR và được thiết kế cẩn thận. Để dễ nắm bắt về độ đặc hiệu, bạn cứ hình dung theo câu chuyện này. Bạn muốn tìm một ngôi nhà với những đặc điểm biết trước ở trong một ngôi làng đông đúc. Lần thứ nhất, bạn cho 2 người bạn thân 2 đặc điểm nhận diện của ngôi nhà đó và nhờ họ vào làng tìm giúp bạn. Hai người bạn đi một hồi và quay về báo với bạn là họ đã tìm ra được 2 ngôi nhà cùng có 2 đặc điểm đó. Bạn bối rối và quyết định đưa ra đặc điểm thứ 3 và nhờ người bạn thân thứ ba đi vào làng kiểm tra 2 ngôi nhà kia. Cuối cùng, người bạn thứ ba trở về và trả lời rằng chỉ có duy nhất 1 căn nhà có cả 3 đặc điểm bạn yêu cầu… Hơi dài dòng, nhưng bạn cứ tưởng tượng 3 người bạn thân của bạn lần lượt là mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò, thì bạn sẽ hiểu tại sao Real-time PCR có độ đặc hiệu cao hơn PCR. 🙂
Thứ tư, PCR không cho phép định lượng chính xác như Real-time PCR. Điều này là hiển nhiên nên tôi không bàn sâu ở đây nhé!
Thứ năm, mất thời gian. Do phải làm thêm bước điện di nên quy trình PCR thường kéo dài hơn 1 tiếng đồng hồ so với quy trình Real-time PCR. Thêm vào đó, bạn cũng phải bỏ công sức và thời gian để chuẩn bị gel agarose. Và đặc biệt, sản phẩm nhân bản của phản ứng PCR thường từ 300 bp đến 1000 bp nên bạn phải cho enzyme Taq polymerase nhiều thời gian hơn để tổng hợp mạch mới. Trong khi đó, sản phẩm nhân bản của phản ứng Real-time PCR thường giới hạn từ 80 bp đến 200 bp nên bạn có thể rút ngắn thời gian tổng hợp này. Đây là một điều mọi người hay bỏ sót khi so sánh thời gian thực hiện giữa 2 quy trình.
Thứ sáu, độc hại. Sự độc hại này xuất phát từ việc sử dụng chất nhuộm DNA là ethidium bromide ở bước điện di. Chất EtBr này là một chất gây ung thư ngay cả khi tiếp xúc qua da. Tuy nhiên, tin mừng là ngày nay có rất nhiều chất nhuộm DNA thay thế EtBr đã được bày bán rộng rãi trên thị trường, giúp dân sinh học phân tử như chúng ta an tâm trong công tác. Mặc dù giá của các chất nhuộm DNA thế hệ mới này khá “chát” nhưng vẫn có nhiều phòng thí nghiệm đồng ý chuyển sang dùng vì … tương lai của con và em chúng ta :).
26,784 total views, 1 views today
Để lại một phản hồi
Bạn phải đăng nhập để gửi phản hồi.