Qua bài viết “Mồi PCR của bạn liệu có nhân bản đúng gien mục tiêu hay không?”, các bạn đã biết chắc rằng cặp mồi của bạn sẽ tạo ra sản phẩm PCR với kích thước mong muốn. Tuy nhiên, liệu cặp mồi này chỉ nhân bản gien mục tiêu thuộc loài A hay là có thể nhân bản cả những gien tương đồng thuộc loài B, C, D, v.v… nữa? Để trả lời câu hỏi này, bạn cần phải đánh giá độ đặc hiệu của mồi PCR.
Trong phạm vi của bài viết này, tôi sẽ trình bày một cách đơn giản để phát hiện những trình tự (loại trừ gien và loài mục tiêu ra) mà cặp mồi PCR của bạn có thể bắt vào và nhân bản. Nếu cặp mồi của bạn có thể bắt được nhiều gien hay loài khác nhau thì chứng tỏ nó không hề đặc hiệu chút nào!
Bước 1: Chép lại trình tự 2 mồi xuôi và mồi ngược được nêu trong bài báo. Lưu ý, trình tự DNA trong các bài báo nếu không có chú thích đặc biệt thì tự hiểu đọc từ trái sang phải là chiều 5′ – 3′. Trong bài viết này, tôi sẽ tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của mồi PCR dùng để nhân bản gien độc tố của vi khuẩn Vibrio cholera.
Bước 2: Vào chương trình Nucleotide BLAST trên trang web NCBI. Đây là một chương trình online hoàn toàn miễn phí. Các trình tự của bạn khi đưa vào chương trình này để đánh giá độ đặc hiệu của mồi PCR sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI.
Bước 3: Nhập trình tự vào ô đầu tiên ở mục Enter Query Sequence theo cú pháp sau. Lưu ý, không có dấu cách nào trong cú pháp và trình tự 2 mồi giữ nguyên như trong bài báo.
<Mồi xuôi> <20 chữ N> <Mồi ngược>
Ví dụ: GGCAGATTCTAGACCTCCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGATGATCTTGGAGCATTC
Chương trình BLAST sẽ hiểu rằng bạn đã nhập vào 1 trình tự dài 59 nucleotide với vùng ở giữa chứa toàn N.
Ở mục Database, chọn “Others” và “Nucleotide collection (nr/nt)
Ở mục Organism, đánh vào “Vibrio cholera”, phần mềm sẽ tự đưa ra tên các loài phù hợp, chọn “Vibrio cholera (taxid:666)”.
Chọn “Exclude” ở bên phải tên loài. Lựa chọn này sẽ cho phần mềm biết rằng bạn muốn loại bỏ tất cả những trình tự thuộc loài mục tiêu của cặp mồi ra khỏi việc tìm kiếm và dò tìm sự bắt cặp của mồi trên những trình tự khác.
Trong mục Optimize for, chọn “Somewhat similar sequences (blastn)”
Bước 4: Nhấp vào dấu cộng (+) bên trái chữ Algorithm parameters để xuất hiện thêm các thông số nâng cao.
Thiết lập Expect threshold đến 1000. Điều này cho phép phần mềm đưa ra cả những trình tự mà cặp mồi có thể bám không hết 100% (vd: có 1-2 nucleotide không giống nhau). Hiện tượng bám có mismatch này vẫn có thể tạo ra sản phẩm PCR dù hiệu suất không cao.
Thiết lập Word size là 7. Đây là chiều dài ngắn nhất mà phần mềm sẽ “cắt” trình tự mồi của bạn thành từng đoạn nhỏ. Đoạn càng nhỏ thì khả năng phát hiện được trình tự mà mồi có thể bám vào (dù không được 100%) càng cao.
Nhấp vào nút BLAST để chạy chương trình!
Nội dung
Cách đọc kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi PCR
Khi có được kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi PCR bằng BLAST, bạn nên xem mục tóm tắt bằng đồ họa (Graphic Summary) trước tiên. Trong mục này, những khối màu đen dài thể hiện trình tự 2 mồi PCR của bạn. Khối bên trái đại diện cho mồi xuôi, khối bên phải đại diện cho mồi ngược (nếu bạn để mồi xuôi bên trái và mồi ngược bên phải ở Bước 3). Những khối màu đen trái và phải nối với nhau bởi 1 đường kẻ mỏng màu đen cho bạn biết rằng mồi xuôi và mồi ngược của bạn cùng xuất hiện trên 1 trình tự lưu trữ trong CSDL GenBank. Nói cách khác, cặp mồi PCR của bạn có thể bám trên trình tự đó (ở 2 mạch khác nhau) và tạo ra sản phẩm PCR.
Quay trở lại với kết quả BLAST của chúng ta, nhấp vào khối màu đen bên trái (hoặc bên phải), bạn có thể thấy rằng, ngoài Vibrio cholerae ra, cặp mồi PCR này còn bám “rất tốt” trên một số loài vi khuẩn khác, ví dụ như trong hình là vi khuẩn Vibrio alginolyticus. Bạn nhấp tiếp vào chữ Aligment để xem kết quả sắp gióng cột cụ thể.
Trong kết quả sắp gióng cột, bạn đánh giá một số tiêu chí cơ bản như sau:
- Identities: 19/19 (100%) nghĩa là mồi xuôi của bạn dài 19 nucleotide và khớp hoàn toàn với trình tự mẫu trong GenBank, nghĩa là sẽ bám được trên trình tự DNA mạch đôi này trong phản ứng PCR.
- Gaps: 0/19 (0%) nghĩa là khi bám vào DNA mẫu này, mồi xuôi của bạn sẽ duỗi thẳng hoàn toàn, không nhấp nhô do các điểm không bắt cặp bên trong lòng mồi.
- Strand:
- Plus/Plus: trình tự mồi xuôi của bạn tương đồng (giống nhau) hoàn toàn với trình tự lưu trữ trong GenBank
- Plus/Minus: trình tự mồi ngược của bạn tương đồng hoàn toàn với trình tự bổ sung với trình tự lưu trữ trong GenBank.
Nếu bạn thấy chỗ này khó hiểu, bạn có thể xem lại hình trình bày mô hình bám của 2 mồi PCR bên dưới.
Kết luận sơ bộ…
Như vậy, qua kết quả sắp gióng cột này tôi thấy rằng cặp mồi PCR đang kiểm tra có thể nhân bản cả vùng gien ctxA của Vibrio alginolyticus và tạo ra sản phẩm PCR có chiều dài 562 bp (lấy vị trí bám lớn nhất của mồi ngược là 564 trừ cho vị trí bám nhỏ nhất của mồi xuôi là 3 và cộng thêm 1 đơn vị, 564 – 3 + 1 = 562 bp). Chiều dài sản phẩm PCR này gần giống như trong bài báo (Lưu ý, trình tự gien ctxA này chỉ là “partial cds”, nghĩa là chưa phải là 1 gien trọn vẹn (chỉ dài 564 nucleotide) nên bị mất 1 nucleotide ở đầu 5′ của mồi ngược)
Qua kết quả này, tôi nghi ngờ về độ đặc hiệu của mồi PCR nhân bản gien độc tố của Vibrio cholerae này và cần kiểm tra thêm trước khi sử dụng.
15,070 total views, 1 views today
