Cách đây hơn 1 năm về trước, tôi từng chia sẻ với bạn đọc về “Ưu và nhược điểm của PCR-Điện di” và đã được đón nhận khá nồng hậu. Qua bài viết này, chắc hẳn các bạn đã biết kỹ thuật PCR – Điện di tồn tại khá nhiều nhược điểm như độ nhạy thấp, khả năng ngoại nhiễm cao, bất tiện, mất nhiều thời gian, v.v… Vậy, nếu các bạn không thể chấp nhận những yếu điểm này, bạn sẽ chọn phương án thay thế là gì? Mặc dù còn phải tùy thuộc vào ứng dụng của bạn, nhưng tôi có thể đề xuất bạn xem qua kỹ thuật Real-time PCR. Tại sao ư? Mời bạn theo dõi bài viết dưới đây về những ưu điểm của kỹ thuật Real-time PCR này.
Nội dung
Hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm do sản phẩm PCR
Đây là một trong những ưu điểm của kỹ thuật Real-time PCR mà tôi luôn luôn tâm đắc nhất. Trong quy trình PCR – Điện di, điều bắt buộc các bạn phải làm khi tiến hành thao tác điện di là mở nắp ống chứa phản ứng PCR. Cái ống này bé lắm, chỉ lớn hơn đầu tăm bông một chút thôi. Và cái nắp của nó thì đôi khi cũng rất cứng. Thế nên, khi cố gắng mở cái nắp này ra, gần như 100% trường hợp, các bạn sẽ vô tình làm văng một ít dung dịch có trong ống ra ngoài không khí, hay tệ hơn là ra cả mặt bàn hay sàn nhà. Và nếu đó là một mẫu dương tính, tức là ống phản ứng đó có chứa đến hàng tỷ sản phẩm nhân bản của gen mục tiêu, bạn nên chuẩn bị tinh thần để giải quyết một thảm họa là vừa rồi đó! Vì sao ư? Những sản phẩm nhân bản này sẽ được phát tán vào không khí, lơ lửng như những … bóng ma, di chuyển qua các phòng và có khả năng rơi vào những phản ứng PCR mới mà bạn đang lui cui chuẩn bị ở những thí nghiệm kế tiếp. Và theo nguyên tắc PCR, sản phẩm nhân bản vẫn có thể được sử dụng làm mạch khuôn để tạo ra thêm hàng tỷ tỷ sản phẩm nhân bản tương tự. Tức là, nói một cách dễ hiểu hơn, nếu một ít sản phẩm PCR của ngày thứ nhất rơi vào phản ứng PCR bạn đang chuẩn bị ở ngày thứ hai, thì chắc chắn phản ứng này của bạn sẽ có kết quả dương tính, cho dù bạn có cho mẫu gì vào nó! Và người ta gọi nó là dương tính giả.
Khoan hãy hoảng sợ! Nếu chuyển qua sử dụng Real-time PCR, bạn sẽ không phải quá lo lắng về vấn đề ngoại nhiễm này. Về nguyên tắc, sự nhân bản xảy ra trong phản ứng Real-time PCR sẽ được theo dõi theo thời gian thực, ngay trên máy Real-time PCR. Và sau khi phản ứng kết thúc, bạn không cần phải đem phản ứng này đi điện di mà vẫn có thể biết kết quả. Vậy là gần như bạn đã tránh được 100% nguy cơ phát tán sản phẩm nhân bản ra ngoài không khí, nguồn gốc của thảm họa ngoại nhiễm!
Real-time PCR có độ nhạy cao
Vì còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bản thân tôi không dám khẳng định lúc nào phản ứng Real-time PCR cũng có độ nhạy cao hơn phản ứng PCR. Nhưng sẽ là rất thiếu sót nếu không bàn luận về độ nhạy khi nói về ưu điểm của kỹ thuật Real-time PCR.
Hình bên trình bày về kết quả so sánh độ nhạy của kỹ thuật Real-time PCR với kỹ thuật PCR-Điện di trong việc phát hiện vi-rút Chikungunya. Trong thí nghiệm này, người ta đã pha loãng dịch vi-rút lần lượt 10 lần từ 107 PFU/ml đến 0.01 PFU/ml (PFU là đơn vị hình thành vòng tan khuẩn, plaque-forming unit). Mười mẫu pha loãng này được bổ sung vào phản ứng Real-time RT-PCR và RT-PCR thường và chạy song song với chương trình đã được tối ưu hóa. Kết quả cho thấy phản ứng Real-time RT-PCR có thể phát hiện được lượng vi-rút thấp đến 0.1 PFU/ml. Phản ứng RT-PCR thường thì chỉ phát hiện được mẫu có nồng độ thấp đến 1 PFU/ml. Điều này có nghĩa là Real-time PCR có độ nhạy cao gấp 10 lần so với PCR thông thường.
Vậy tại sao Real-time PCR lại có thể nhạy hơn PCR-Điện di? Tôi có thể kể ra một số yếu tố quyết định sau đây. Thứ nhất, trong phản ứng Real-time PCR, người ta có sử dụng thêm các chất phát huỳnh quang hoặc mẫu dò huỳnh quang với cường độ phát quang cao. Khi kết hợp với hệ thống đọc tín hiệu siêu nhạy của máy Real-time PCR, các chất phát huỳnh quang này cho phép chúng ta quan sát được sự nhân bản ngay cả khi hàm lượng mạch khuôn ban đầu là rất ít, ví dụ: 10 mạch khuôn / phản ứng. Kế đến, trong quy trình PCR thông thường, chúng ta cần thực hiện thêm bước điện di. Việc có thêm thao tác trong một quy trình như thế này sẽ làm gia tăng sai số và nhiều khả năng làm giảm độ nhạy. Và thứ ba, những vấn đề liên quan đến chất lượng gel điện di, chất lượng chất nhuộm DNA sử dụng trong điện di và hoạt động của máy chụp ảnh gel hay bàn đèn UV đều có khả năng làm giảm độ nhạy của cả quy trình PCR-Điện di.
Tiện lợi là một ưu điểm của kỹ thuật Real-time PCR
Để hiểu vì sao tôi nói tiện lợi là một ưu điểm của kỹ thuật Real-time PCR, tôi sẽ liệt kê giúp bạn một vài công việc bạn phải làm với bước điện di trong quy trình PCR-Điện di thông thường.
Đầu tiên, bạn phải đổ một miếng gel agarose. Bạn phải cân agarose và đổ nó vào một cái chai dày và nặng, có chứa dung dịch đệm. Rồi bạn phải đun cái chai 10-15 phút trong lò vi sóng để làm tan agarose hoàn toàn. Bạn sẽ hết sức căng thẳng khi phải thò cái bàn tay mỏng manh của mình vào cái lò vi sóng chật hẹp để lôi cái chai nóng nghi ngút ra ngoài. Nếu bạn chọn phương án cho chất nhuộm DNA như Ethidium bromide vào thẳng gel thì bạn phải ngồi chờ gel nguội đi một chút rồi mới được cho chất nhuộm vào. Rồi bạn phải lắc cái chai nhè nhẹ cho chất nhuộm phân tán đều vào gel mà không được tạo ra bọt khí! Cực kỳ căng thẳng và luôn luôn đổ mồ hôi hột đấy bạn ạ.
Khi đến bước nạp mẫu vào gel, bạn sẽ phải lui cui hút sản phẩm PCR ra bên ngoài để trộn với dung dịch nạp mẫu. Rồi bạn cũng phải vô cùng cẩn thận khi chuyển toàn bộ hỗn hợp này vào giếng. Bạn phải căng mắt và giữ bàn tay thật chặt để làm sao hỗn hợp rơi hoàn hảo vào giếng mà không làm rách giếng. Thao tác này chưa hẳn là một vấn đề lớn nếu lượng mẫu phân tích ít. Nhưng khi bạn phải nạp đến 50 hay 100 mẫu trong một lần chạy thì tôi chắc chắn bạn ít nhiều sẽ nghỉ đến việc bỏ nghề ngay sau đó… 🙁
Và, nếu bạn không cho chất nhuộm DNA vào gel ngay từ đầu, sau khi điện di xong, bạn sẽ phải đem gel đi nhuộm và giải nhuộm với dung dịch có chứa chất nhuộm. Thao tác này không phức tạp nhưng chắc chắn nó sẽ lấy đi 15-30 phút của bạn, tùy vào hàm lượng sản phẩm PCR có trong gel của bạn.
Với Real-time PCR, bạn có thể quên đi những thao tác phiền phức tôi vừa nêu trên! Điều duy nhất bạn phải làm khi sử dụng kỹ thuật Real-time PCR là ngồi nhâm nhi ly cà phê, miếng bánh và chờ kết quả xuất hiện trên màn hình vi tính của mình thôi.
Bài viết thuộc bản quyền của Sinh Học Phân Tử Bên Giảng Đường.
11,770 total views, 2 views today
